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以PD-L1為例,教你不錯過WB實驗中看似不對勁的條帶

發布時間:2019-08-09 ?? 瀏覽:

有時,眼見不一定為“實”!咋一眼看上去的條帶大小與預測的分子量不一致,第一反應就是——哪里出了問題?其實,看到的條帶位置不正確不一定就真的不正確!面臨WB 實驗條帶位置的問題,我們需要透過現象看本質,挖掘研究靶蛋白的具體特征來判斷條帶的正確位置。

如何獲得正確條帶

頒給了在腫瘤免疫領域做出突出貢獻的美國免疫學家詹姆斯·艾利森(James P Alison)和日本免疫學家本庶佑(Tasuku Honjo),以表彰兩位科學家發現了抑制免疫調節的癌癥療法。這種全新的癌癥免疫治療的方法拯救了許多癌癥患者,同時,CTLA-4、PD-1、PD-L1等T細胞表面表達的分子也備受科研工作者的關注。PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌和腎細胞癌等許多腫瘤類型的細胞中表達 【1-3】,因而對PD-L1的表達情況的研究成了很多課題解開腫瘤免疫奧秘的首要任務。但對初出茅廬的同學們來說,可能判斷PD-L1等蛋白的正確WB 條帶位置很不容易。

要獲得正確的蛋白條帶,一般要從以下幾個方面著手。

1)了解該蛋白的特點

蛋白的特點,對條帶的位置影響很大,也是判斷條帶位置是否正確的最重要依據。通過一些網站了解要研究蛋白的特點,如 Uniprot 等。以下這些特點會導致實際分子量與預測的分子量不一致。

a.該蛋白是否容易發生修飾

b.該蛋白是否容易產生聚合體

c.該蛋白是否具有各種同工型或異構體

d.該蛋白不同種屬來源的分子量是否一致

2)了解該蛋白的實際觀察到分子量

a.參考抗體說明書

b.參考高質量的文獻

3)樣本的裂解程度

a.通過勻漿、超聲等物理作用讓樣本充分裂解

b.選擇合適的蛋白裂解液,保證目的蛋白充分富集

4)抗體的特異性

使用經過驗證而高特異性的抗體

5)其他WB 實驗的細節

a.膠本身的狀態及電泳的條件會導致分子量的遷移

b.不合適的封閉液、洗膜液、抗體稀釋液等導致條帶偏移

有了以上的要點,當我們無法判斷條帶位置是否正確時,就可以一一對應起來排查了。

以PD-L1為例(如圖1),在不同的樣本中,我看到的條帶大小位置不一樣,但是在Uniprot預測的分子量是33kD,那么到底哪個/些條帶的位置是對的呢?


似乎只有Jurkat 細胞實驗得出來與預測的分子量一致的條帶,可是圖中在大約55kD的位置也多了一條帶,不好判斷呢。另外三組結果,不是位置不在33kD (在 Human skeletal muscle tissue 中觀察到的條帶大約是40KD), 就是有高背景的拖帶現象(在 HLDM-2細胞中是40-60kD之間,在NCI-H1975細胞中是40-50kD之間),看起來更不可能正確。到底哪組是正確的呢?

我們一一根據上述的要點來排查。

1) 參考Uniprot。

理論上,Uniprot預測的分子量是33kd。但是實際上,由于PD-L1 非常容易發生糖基化修飾,在大部分樣本中看到的實際分子量都是在40kD-60kD 之間的,因此,在Human skeletal muscle tissue、HLDM-2、NCI-H1975 看到的條帶都是蛋白翻譯后高度糖基化修飾的結果,Jurkat 細胞中55kd 的條帶也是發生乙糖基化的另一條帶,是PD-L1表達的另一種形式。

2) 參考抗體說明書。

以 CST 產品 PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (E1J2J™) Rabbit mAb #15165 為例,說明書中給出的分子量是40-50 kD(如圖2), 并且在不同的樣本中驗證確實是在40-50kD 之間,因此,判斷抗體識別蛋白的分子量最好參考抗體的說明書,以說明書為準。



另外,文獻上的數據也可以參考,如圖3,使用E1J2J克隆的抗體在PC9野生型的細胞中觀察到的實際分子量是在40-60kD的,這是正確的蛋白表達,不能由于不是理論上的33kD 就一直糾結實驗的結果。


以上兩點在很大程度在可以幫忙判斷蛋白條帶的位置是否正確。

3)& 4)樣本本身裂解不完全、抗體不特異也會導致出現與預測不一樣的條帶。

這兩點我們完全可以通過提高樣本和抗體的質量來解決。

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