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你是否想過:我的 WB 內參是否選擇正確?

發布時間:2019-08-09 ?? 瀏覽:

要想底氣十足地秀出你的WB實驗結果,單單內參對照就是一門學問。在對靶蛋白進行分析時,首先考慮是否等量上樣,其次考慮信號是否屬于檢測的線性范圍。那么,內參蛋白就尤為重要!

通常,第一感覺內參蛋白就是 β-actin 或 GAPDH 等。實際上,可以選擇的內參有很多,而選擇內參有一定的標準。第一,實驗條件不能改變內參蛋白上樣量( 實驗條件對經典內參的影響)。第二,對照內參的分子量必須與靶蛋白不同。第三,也是最重要的一點,檢測到的內參蛋白和靶蛋白的信號必須在一個線性范圍內,否則你會發現你的條帶無法進行定量。

然而,實際操作中,很多同學沒有意識到上述的第三個標準。他們認為,印跡上的內參蛋白數量與細胞數量成正比,但這可能是錯誤性的假設而已,特別是使用單個內參蛋白對多種 WB 實驗進行標準化時 (1)。實際上,沒有一種內參蛋白能同時滿足以上3 點標準,又適用于你各種不同靶點的實驗。通常內參蛋白遠比靶蛋白豐富得多。在同一稀釋度下,測定內參和靶蛋白時,內參蛋白的信號可能較為飽和,甚至會超過檢測線性動態范圍,這就導致不能報告出泳道之間的差異。

接下來,舉兩則案例,讓你了解信號飽和對條帶、實驗的影響。

案例一

如圖1,過量上樣或蛋白含量過高會導致條帶殘缺,或“呈燃盡狀”/“凹陷狀”的條帶,而不是有序條帶,這表明 HRP 偶聯二抗已耗盡化學發光試劑。這種情況下,可能還伴隨著膜上有褐色斑點,這是過氧化物酶過度活化的一種副產物。


你的內參蛋白有沒有顯出這模樣?

如果你的膜上沒有出現上述的“怪異”條帶或褐色斑點,這也不能說明你的內參蛋白在靶蛋白的線性范圍內。即使內參條帶看起來較為有序,但仍然可能是飽和的 (2)。所以為了證明內參蛋白和靶蛋白的線性,在同一 WB 實驗中梯度上樣一系列樣品稀釋液,或同時轉移多個印記以避免轉移效率變化 (2, 3),對蛋白上樣量、一抗和/或化學發光試劑可進行滴定測試。

案例二:

下面的例子顯示需要更長和更短曝光才能分別獲得 HNF1 和 GAPDH 的線性信號。這說明在該情況下,GAPDH和HNF1的信號不在一個線性范圍內。

使用 HNF1α (D7Z2Q) Rabbit mAb #89670(左圖)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(右圖)對不同細胞系的提取物進行 WB 分析。

當然 WB 的信號也與檢測方法緊密相關。與膠片相比,使用電荷耦合器件 (CCD) 相機檢測增強型化學發光 (ECL) 可產生出色的線性動態范圍。如果數字信號飽和,則可以使用軟件設置來顯示紅色像素。經證實,熒光掃描(使用與熒光染料而不是過氧化物酶偶聯的二抗)可避免發光化學的固有限制,因而更好。所以在設置實驗時,采用這些方法可能意味著更少的梯度稀釋次數。但如果你的實驗室無法使用最新最好的技術,你也可以使用傳統 ECL 和膠片獲得較好的數據,但需要你花時間設置實驗,解決等量上樣和動態范圍問題。

既往還有文獻推薦在做實驗前,最好考慮使用 5 個內參蛋白 (2, 3),這有助于你發現至少一個(好的時候多個)在靶蛋白線性范圍內的內參,但使用多個內參蛋白存在耗費時間、試劑的問題,特別是樣品珍貴的情況下。所以相對可行的是測定每個樣品泳道中的總蛋白上樣量,無需探測多個內參蛋白。對每個泳道 (1) 的所有蛋白條帶或多個離散條帶 (3) 進行染色和掃描,同時還要確保染色劑不會干擾后續的免疫檢測。

對于許多研究生和博士后,可能會覺得進行 WB 實驗是“常規程序”。但也不要忘了,解釋實驗的數據時,細節決定成敗。仔細考慮樣品制備、轉移條件和一抗等問題,將幫助你避免出現失誤 (2, 4-5)。到了文章發表的時候,記得提供所有詳細信息,以便其他人準確評估結果并重復做出實驗。這才是負責地進行 WB 實驗嘛!

【參考文獻】

Eaton SL, Roche SL, Llavero Hurtado M, Oldknow KJ, Farquharson C, Gillingwater TH, Wishart TM (2013) Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLos One 8(8):e72457.

Janes KA (2015) An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Sci. Signal.8(371): rs2.

McDonough AA, Veiras LC, Minas JN, Ralph DL (2015) Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot. Am J Physiol Cell Physiol. 308(6):C426-33.

Ghosh R, Gilda JE, Gomes AV (2014) The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11(5):549-60.

Gorr TA, Vogel J. (2015) Western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues. Proteomics Clin Appl. 9(3-4):396-405.

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